Cara Pewarnaan Gram, Fungsi Pewarnaan, serta Metodelogi Pewarnaan Gram

Cara Pewarnaan Gram, fungsi gram, dan metodelogin pewarnaan Gram

Pada tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu 1)organisme yang dapat menajahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positive; 2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negative (Hadieotomo,1988).

Pewarnaan Gram (+-)

Dalam bidang medis misalkan, masih dibutuhkannya sistem sterilisasi temperatur rendah yang mampu membasmi bervariasi mikroorganisme yang tergolong dalam Gram negative bacteria, Gram positive bacteria dan yeast. Bidang medis inilah bidang yang setiap saat mengalami kontaminasi oleh berbagai jenis bakteri dan yeast. Mikroorganisme ini menempati permukaan peralatan medis (health care facilities) pada hampir semua tempat dirumah sakit. Peralatan-peralatan tersebut kini banyak yang terbuat dari bahan-bahan yang tidak tahan terhadap termik seperti plastik, kertas, dll (Nufailah,et,al,2005).

Pada pewarnaan Gram terdapat 2 jenis bakteri yaitu bakteri positive dan bakteri negative. Bakteri positive berwarna ungu karena didalamnya mengikat zat warna kristal ungu iodium. Sedangkan bakteri Gram negative berwarna merah karena mengikat warna sekunder. Pada dinding sel bakteri Gram positive dinding selnya tebal sedangkan pada bakteri Gram negative dinding selnya tipis.

Tujuan Pewarnaan Gram

Menurut Waluyo (2008), tujuan dari pewarnaan adalah :

• Memudahkan melihat mikrobe dengan mikroskop
• Memperjelas ukuran dan bentuk mikrobe
• Melihat struktur dalam bakteri , seperti dinding sel dan vakuola
• Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna

       Menurut Volk (1992), pewarnaan Gram pada tahun 1884 seorang dokter berkebangsaan Denmark Christian Gram membuat zat pewarna khusus yang barang kali terpenting penggunaannya dalam bakteriologi. Zat pewarna tersebut adalah pewarna dieferensial, karena dapat membagi bakteri sejati menjadi 2 kelompok fisiologi, dengan demikian sangat memudahkan identifikasi jenis.

Macam dan fungsi pewarnaan

Menurut Hadieotomo (1988), pewarnaan ini merupakan salah satu yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu : 1) organisme yang dapat menajahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positive; 2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negative.

Menurut Volk (1992), pewarnaan mungkin merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Ada 5 macam pewarnaan, yaitu : 1)Pewarnaan sederhana, memungkinkan untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dalam morfologi yang sama, 2)Pewarnaan tahan asam, untuk pewarnaan bakteri yang mengandung sejumlah besar besar zat lipoid (berlemak) didalam dinding selnya yang menyebabkan tidak permeabel terhadap zat warna yang umum, 3)Pewarnaan spora, untuk pewarnaan bakteri yang membentuk endospora yang tahan terhadap kondisi ekstrim sehingga dibutuhkan perlakuan yang keras, 4)Pewarnaan kapsul, 5)Pewarnaa negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya hitam gelap.

Perbedaan gram positif dan gram negatif

Menurut Hadioetomo (1988), diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri Gram positive berbeda dengan bakteri Gram negative. Dinding sel yang lebih yang tebal pada bakteri Gram positive menyusul oleh perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi. Sedangkan sel-sel Gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Contoh dari Gram positive adalah S.aureus dan Gram negative adalah E.coli.

Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram positive dan Gram negative sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri Gram positive terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri Gram negative mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram negative (Lay,1994).

Metodelogi pewarnaan gram

Alat dan fungsi

Alat yang digunakan dalam praktikum Mikrobiologi Dasar tentang Pewarnaan Gram sebagai berikut :

·        Incase                         : menginkubasi alat dan media pada suhu kamar 25-27’C

Jarum loop                 : untuk inokulasi dari media pada ke cair atau sebaliknya

Objek glass                 : untuk tempat bakteri

Mikroskop        : untuk mengamati mikroorganisme yang tidak dapat dilihat oleh mata telanjang

Sprayer                      : untuk wadah alkohol 0,70%

Nampan                      : untuk tempat alat dan bahan

Pipet tetes                  : untuk mengambil larutan dalam skala kecil ukuran 1-10ml

Cover glass                : untuk menutup objek glass

Bunsen                       : sebagai pemanas dalam skala kecil dan pengkondisian   steril

Rak tabung reaksi     : untuk tempat tabung reaksi

Bahan dan fungsi

Bahan yang digunakan dalam praktikum Mikrobiologi Dasar tentang Pewarnaan Gram sebagai berikut:

Aquadest    : untuk membilas larutan

Etanol         : indikator untuk melunturkan lemak

Safranin      : Indikator untuk pewarna sekunder

Kristal ungu : indikator untuk pewarna primer

Iodium         : indikator untuk memperkuat warna

Kertas label : untuk menandai alat atau bahan

Tissue          : untuk membersihkan alat dan bahan

Alkohol 70% : untuk mensterilkan tangan dan daerah pengamatan.

Cara kerja

Pada praktikum Mikrobiologi Dasar materi pewarnaan Gram yang pertama kali dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan. Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, objek glass, bunsen, jarum loop, pipet tetes, dan mikroskop. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah NA, kristal ungu, iodium, etanol 70%, safranin, dan aquadest.

Langkah selanjutnya adalah diambil bakteri dari media isolasi menggunakan jarum loop karena apabila menggunakan jarum ose dapat merusak media. Jarum loop juga terlebih dahulu dipanaskan diatas bunsen agar kondisinya aseptis. Setelah itu disentuhkan pada medium yang tidak ada bakterinya, karena jika kondisi terlalu panas bakteri bisa mati. Setelah itu diambil bakteri dan digoreskan pada objek glass. Kemudian objek glass difiksasi di dekat bunsen untuk mengkondisikan aseptis dan untuk memperluas struktur internal dan eksternal dari sel dan mikroorganisme. Kemudian ditetesi dengan kristal ungu menggunakan pipet tetes dan didiamkan selama 1 menit. Hal ini bertujuan karena pada saat 1 menit diasumsikan sudah mengunci kristal ungu dan fungsi dari kristal ungu sendiri adalah sebagai pewarna primer.

Setelah itu dibilas dengan aquadest, hal ini bertujuan agar sisa kristal ungu yang dapat luntur dan memperjelas pengamatan. Setelah dibilas dengan aquadest, lalu ditetesi dengan iodium dan dibiarkan selama 2 menit, iodium berfungsi sebagai penguat warna kristal ungu, dan didiamkan selama 2 menit karena pada waktu diasumsikan telah cukup jelas memberikan warna ungu pada bakteri. Setelah itu dibilas lagi dengan aquadest, hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa iodium pada bakteri. Kemudian dicuci dengan etanol 70% berfungsi untuk melarutkan lemak, kemudian dibilas kembali dengan aquadest. Hal ini bertujuan untuk memperjelas pengamatan. Setelah itu ditetesi dengan safranin. Safranin berfungsi sebagai pewarna sekunder dan sebagai tanda bahwa bakteri tersebut merupakan Gram negatrif. Dibiarkan   menit karena waktu tersebut diasumsikan bahwa dinding sel telah mengunci safranin. Kemudian dibilas dengan aquadest, hal ini bertujuan untuk membilas sisa safranin dan untuk memperjelas pengamatan. Kemudian diamati preparat dibawah mikroskop lalu digambar sesuai hasil yang diamati.

Analisa Hasil

Pada praktikum Mikrobiologi Dasar tentang pewarnaan Gram didapatkan hasil sebagai berikut:

Gambar yang diambil dari mikroskop ini setelah proses pewarnaan Gram pada media NA10-5B. Hasilnya berwarna ungu (Gram positif) karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat warna kristal ungu iodium.

Gambar ini diambil dari mikroskop setelah proses pewarnaan Gram, bakteri yang diambil berasal dari media NA 10-4A. Hasilnya berwarna merah Gram negatif karena mengikat warna sekunder.

Menurut Hadieotomo (1988), bakteri dapat dipisahkan secara umum 2 kelompok besar yaitu: 1) 1)organisme yang dapat menajahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positive; 2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negative.